中国医药生物技术协会发布


目次

前言II

引言III

1 范围1

2 术语和定义1

3 基本要求2

3.1 基本原则2

3.2 人员的要求2

3.3 场所和设施2

3.4 物料2

4 载体制备3

4.1 质粒制备3

4.2 非病毒载体制备的基本要求3

4.3 病毒载体制备的基本要求3

5 细胞制备过程中的要求3

5.1 样本的要求3

5.2T细胞的采集和分离4

5.3 操作的要求4

5.4 细胞转导及扩增的要求4

5.5 安全性及有效性检测5

5.6CAR-T细胞制剂的质量要求5

5.7CAR-T细胞冻存、运输与复苏的要求5

6CAR-T制剂的质量控制与放行5

7 追溯5

8 保密原则6

9 附则6

参考文献7

 

前言

本标准按照GB/T 1.12009《标准化工作导则  第1部分:标准的结构和编写》给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中国医药生物技术协会制定,由中国医药生物技术协会实施。

本标准起草单位:中国医药生物技术协会医药生物技术临床应用专业委员会。

本标准主要起草人:。

本标准为首次发布。

 

引言

近年来,免疫治疗经历了一系列突飞猛进的发展,以特异性过继免疫细胞疗法及免疫检查点抗体疗法为代表的新型免疫治疗技术因其在临床研究中取得的显著疗效而成为学术界和产业界共同关注的焦点。其中,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell ImmunotherapyCAR-T疗法)因其在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中展现出显著的治疗效果而成为国内外研究的热点。随着我国对CAR-T技术的研究不断深入,国内企业的积极布局和产业链的延伸,我国的CAR-T细胞治疗技术也在紧随国际趋势的发展。

然而,目前国内关于CAR-T细胞的制备和质量控制缺乏统一的标准和管理规范,各制备机构或应用机构之间无法进行正常的评估和交流,一定程度上不利于细胞治疗产业的专业化发展。只有确立了安全、规范、稳定、可追溯的行业规范,才能从源头保证整个CAR-T细胞治疗产业的规范性和安全性。

为了适应我国CAR-T细胞治疗产业的需要,加强CAR-T细胞治疗的管理,规范细胞制备过程,保证CAR-T细胞制品在临床应用的安全性,促进国际间同行的交流,有必要制定中国医药生物技术行业的CAR-T细胞制剂制备质量管理规范。


嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T细胞)

制剂制备质量管理规范


1 范围

1.1 为协助CAR-T细胞制剂制备机构(以下简称机构)在制备过程中避免污染、交叉污染、混淆及差错,且保证CAR-T细胞制剂的安全性、生物学效应,参照《免疫细胞制剂制备质量管理自律规范》等相关规定和指导原则,制定本规范。

1.2 本规范所称的CAR-T指用于治疗的、经体外基因导入后表达嵌合型抗原受体的人源T细胞,T细胞来源于患者自体或异体外周血淋巴细胞。

1.3 本规范适用于CAR-T细胞制剂制备的所有阶段。

2 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。  

2.1  

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)  Chimeric Antigen Receptor T Cell,CAR-T cell

经过基因工程修饰的,可表达被导入的含有抗原识别片段、T细胞受体活化分子、共刺激信号等信号分子的CAR基因的T细胞。

2.2 

外周血单个核细胞  Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC

血液中具有单个核的细胞,主要包括淋巴细胞,单核细胞,巨噬细胞,树突状细胞和少量其他细胞类型。

2.3 

质粒  Plasmid

是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子,是基因工程最常见的运载体。

2.4 

目的基因  Target Gene

人工构建的具有明确功能的基因或基因片段。

2.5 

载体  Vector

在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞中进行复制和表达的工具。常用的载体包括质粒、慢病毒、逆转录病毒等。

2.6 

转导  Transduction

借助病毒等方法将外源性遗传物质(DNA或RNA)导入细胞进行稳定表达的过程。

2.7 

冻存液  Cryoprotectant

当与活细胞相结合时,能保护细胞在冷冻和复苏过程不受损害的溶液或试剂。

2.8 

标识  Label

粘贴或附着在对象上的用于区分不同对象的标记、注释或条码。

2.9 

细胞批次  Cell Batch

指取自个体的一次采集的细胞,经生产全过程制成的终末细胞培养物或收获物。

3 基本要求

3.1 基本原则

CAR-T细胞制剂的制备包括质粒的制备、病毒的制备、样本的接收和处理、细胞刺激、转导、扩增、收获、质量检测以及冻存、运输等全过程。对各个操作环节以及环境和人员等都有严格的要求以确保最终产品符合标准。

3.2 人员的要求

3.2.1 机构应配备与其规模相适应的专门的CAR-T细胞制剂制备人员和质量检测人员,操作人员应具备基本的专业知识,并接受特定的专业技术培训后方可上岗。病毒构建和细胞制备技术人员身体健康无传染性疾病,能熟练掌握无菌操作技能,并具备GMP级病毒构建或人T细胞培养经验。

3.2.2 建立人员卫生操作规程和自我防护规程,最大限度地降低人员对细胞制备造成污染以及操作人员自我感染的风险。操作规程应当包括与健康、卫生习惯及人员着装相关的内容,以及操作过程中避免交叉感染和污物正确处理方法等内容。参观人员和未经培训的人员不得进入制备区和质控区。

3.3 场所和设施

3.3.1 CAR-T细胞制剂制备场所分为洁净区及非洁净区。洁净区各功能区包括细胞制备区、细胞储存区、病毒制备区、病毒储存区、中控区、部分质控区(无菌检测室、微生物限度室、阳性对照室、细胞操作室等)等,各个区域相互独立,病毒制备区、病毒储存区、阳性对照室应具有独立的空调系统。非洁净区包括部分质控区(革兰氏染色、内毒素测定、流式细胞仪检测等)、留样室、办公室、资料档案室、物料储存室、气体储存室等,不应与洁净区交叉过往。机构可根据实际情况合理分配各区。

3.3.2 洁净区应当根据制备流程及相应的洁净度级别要求合理设计、布局和使用。洁净区应以温湿度、微粒、微生物、压差为主要控制参数。

3.4 物料

3.4.1 CAR-T细胞制剂制备所用的物料是指制备中所使用的试剂耗材、生物活性分子以及与细胞制剂直接接触的包装材料及外包装材料等。

3.4.2 CAR-T细胞制剂制备所用的样本及物料应当符合相应的质量标准。进口物料应当符合国家相关的进口管理规定。细胞制剂制备中使用的物料管理应参照《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》。

4 载体制备

4.1 质粒制备

4.1.1 质粒应序列信息明确,并得到准确的鉴定和确认。

4.1.2 质粒的质量应经过检测,包括但不限于:

a) 纯度:超螺旋型的含量,细菌基因组DNA、RNA和蛋白残留量;

b) 无菌试验;

c) 热原质试验;

d) 过敏试验;

e) 异常毒性试验;

f) 介导目的基因的活性检测;

g) 有害物质残余量的测定。

4.2 非病毒载体制备的基本要求

非病毒载体(包括但不限于DNA、RNA,蛋白质) 应有明确的来源、结构和遗传特性,制备过程应符合GMP标准,达到相应质量标准的要求。应不含有支原体、细菌及病毒,内毒素等其他外源因子应控制在限定范围内;根据所选择载体类型不同,可综合参考《细胞制品研究与评价技术指导原则》(试行)并分别参考《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》、《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》等相关指导原则开展相关技术研究。

4.3 病毒载体制备的基本要求

4.3.1 病毒包装所使用的细胞系应有明确来源和批次信息,并有详细记录;应不含有支原体、细菌及病毒,内毒素等其他外源因子应控制在限定范围内;应通过表型或生物化学等方法进行检测来确保其性质和均一性。

4.3.2 应提供病毒包装所用细胞系的细胞培养液的详细成分并应具有溯源性,如使用人或动物源性成分,如血清、胰蛋白酶或其他生物学活性的物质,应具有这些成分的来源、批号、质量控制、检测结果和质量保证的相关信息,并确保其不含有特定动物源性病毒成分。

4.3.3 每一批用于转导的病毒应经过检测,包括但不限于:

鉴别试验。根据生产过程中引入的风险,进行与其他病毒的交叉检测,如腺病毒、EBV、CMV、HAV、HBV、HIV、HTLV等;

病毒复制能力(RCR)检测(生产时的批次和冻存复苏时的批次);

无菌试验;

内毒素检测;

支原体检测;

残留量测定:应根据生产工艺及成品的添加成份,对有潜在危险性的成份进行残留量检测。如病毒生产工艺中使用牛血清则需检测牛血清白蛋白残留量;制剂需检测总DNA残留;对于使用转入SV40基因的293T细胞进行病毒生产的,需检测SV40序列的残留等;

病毒滴度测定;

效力试验:插入基因的蛋白表达水平测定及生物学活性测定。

4.3.4 病毒应进行有效期研究,并在有效期内使用。病毒应储存于合适的环境中,确保病毒的无菌性以及效价的持久性。

5 细胞制备过程中的要求

5.1 样本的要求

5.1.1 样本送达时应附细胞制备申请单,内容包括但不限于:

患者基本信息:姓名、性别、年龄、身份证号等必要信息;

患者的临床医学信息:既往史、现病史、临床诊断、病理诊断、肿瘤特异性靶点信息;

实验室检测的结果:血常规及分类、病毒四项检查(HIV、HCV、HBV、梅毒)、肝肾功能;

治疗方案:细胞的种类、治疗次数、回输方式等;

知情同意书。

5.2 T细胞的采集和分离

5.2.1 应在国家卫生部门认可的采血科室,应用全自动血细胞分离机,按单核细胞分离程序,采集外周单个核细胞富集血,或应用合格的医疗器材通过静脉采取患者外周血。根据制备要求对采集的外周血进行单个核细胞的分离及T细胞的分选,并对所分选出的T细胞进行刺激和活化。

5.2.2 应对患者进行血常规及乙型肝炎病毒(HBV)检测,乙型肝炎病毒阳性患者的T细胞需在专用细胞处理间进行细胞分离、培养、收集,完成制备过程。

5.2.3 采集管路需使用一次性消耗品,血细胞分离机定期进行清洁和检测。

5.2.4 在符合洁净要求的操作间分离PBMC,根据病人情况或实验要求再进一步确定是否分选特定细胞亚群进行转导,转导前进行细胞计数及细胞存活率测定。活化T细胞所采用的刺激抗体或磁珠抗体应符合相关质量要求。

5.2.5 培养过程中对培养基、活性因子等外源蛋白的要求如下:

a) 所有使用的培养基、活性因子等外源蛋白应有明确的来源及批号,应有质量检定合格报告。

b) CAR-T细胞体外扩增培养应避免使用异种、异体血清或血浆。所有成分应明确并符合无菌、低内毒素的质量标准,制剂中残留的培养基成分应对回输者无不良影响。

5.3 操作的要求

5.3.1 CAR-T细胞制剂的制备应当按照经过验证后批准的操作规程的要求进行,并有相关记录,以确保CAR-T细胞制剂达到规定的质量标准。

5.3.2 在感染性样本操作区以及病毒的制备区内,操作人员应当穿戴该区域专用的防护服。

5.3.3 同一个培养箱内不得同时存放两个不同批次的细胞培养产品,以免混淆造成严重后果。应在细胞培养耗材及培养箱上进行标识。

5.3.4 应当建立CAR-T细胞制剂以及病毒的批号编制规程和确定收获日期的操作规程。收获日期应明确日期及时间。每批细胞制剂以及病毒均应当编制唯一的批号,并建立细胞制剂以及病毒的出入登记记录制度。

5.3.5 操作前还应当检查所领用的包装材料正确无误,核对待包装产品和所用包装材料的名称、规格、数量、质量状态,且与操作规程相符。

5.4 细胞转导及扩增的要求

5.4.1 细胞转导主要包括非病毒转导和病毒转导2种方式,应确认基因导入系统并对其进行验证,每一操作步骤必须鉴定其结果,转导过程及结果应有记录。

5.4.2 应注意安全操作,转导过程中所使用的培养皿或培养袋等耗材和细胞因子等均需符合临床应用标准。

5.4.3 细胞扩增过程中每一步应准确计数并注意细胞浓度调整及培养时间以保证扩增后数量达到临床要求。

5.5 安全性及有效性检测

5.5.1 体外试验:应检验该CAR-T细胞目的基因的表达情况,及其对目标抗原阳性肿瘤细胞特异性杀伤作用的情况。

5.5.2 体内试验:应至少有一批动物实验结果,证明该CAR-T细胞在动物体内的安全性和有效性。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。

5.6 CAR-T细胞制剂的质量要求

5.6.1 应进行无菌试验和支原体检测。

5.6.2 应进行内毒素检测。

5.6.3 如果细胞培养基内添加成分可能会对细胞制剂质量或安全性产生影响,应对培养基及其他添加成分残余量进行检测,如细胞因子等。

5.6.4 使用磁珠抗体刺激T细胞的,应检测细胞中的残余磁珠量。

5.6.5 应对细胞存活率和回输数量进行检测。

5.6.6 应对终产品中CAR-T细胞转导率、免疫表型进行检测。

5.6.7 应检测CAR-T细胞制剂对特异性肿瘤细胞的杀伤作用。如果制备的是异体CAR-T细胞,还应检测CAR-T细胞对正常细胞的杀伤。

5.6.8 用病毒转导细胞并对病毒RCR完成检测之后,应留取部分CAR-T细胞以备将来需要时对RCR的检测。应进行RCR的长期随访检测。

5.7 CAR-T细胞冻存、运输与复苏的要求

5.7.1 CAR-T产品应用之前可先冻存,待质控试验结束证实结果无问题后再复苏并进行回输。

5.7.2 冻存、运输与复苏的方法、冻存液以及冻存容器等应经过验证,保证细胞质量和安全性。

6 CAR-T制剂的质量控制与放行

6.1 机构应具有CAR-T细胞制剂的检测能力,并配备相关专业技术人员和设备,建立制剂质量控制检测标准和操作规程,确立制剂质量检验和放行的操作规程,所有的检测方法应经过验证。对整个制备过程中各个环节的质量控制均符合标准方可进行临床应用。

6.2 每批次的CAR-T细胞制剂质量标准的检测项目应至少包括:无菌检测、支原体检测、内毒素检测、外源血清残留、细胞存活率、细胞数量、细胞表型、效应细胞比率、CAR转导效率、复制型病毒等,检测方法参见现行版《中国药典》生物制品相关规程。

7 追溯

应建立完整的细胞制备过程记录系统以及标识标签系统和免疫细胞制剂编码系统,以确保CAR-T细胞制剂的辨识并防止制剂混杂,确保其唯一性和可追溯性。记录和标识应当遵循相关法律和规范的要求。细胞制备记录包括每天的细胞状况,细胞数量,转导条件,细胞因子浓度等具体信息。标识系统应记录患者姓名、 病历号、病种、细胞制剂名称、批号、收获日期及时间、规格(细胞数量/体积)、储存条件、效期(精确时间)等。每个患者的信息应当双人复核。每份CAR-T细胞制剂必须编制唯一的编码,通过它能追溯到患者信息以及该细胞制剂操作和最终处理的所有记录,并建立相关程序能够关联新旧编码。

8 保密原则

应采取措施,保证病人的隐私信息不被泄露。

9 附则

其他关于免疫细胞制备的要求以及人员、设备、样品储存与运输、标识与追溯系统等细则,参见中国医药生物技术协会制定的《免疫细胞制剂制备质量管理自律规范》。

 

参考文献

[1] 食品药品监管总局,细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行),2017.

[2] 药品生产质量管理规范(2010修订)(卫生部令第79号).

[3] 国家药典委员会,中华人民共和国药典,2015.

[4] 中国医药生物技术协会免疫细胞制剂制备质量管理自律规范,2016.