1. 适用范围

    本操作说明适用于PBMCCD3CD4CD8CD19NK等冻存细胞的复苏操作过程。

  2. 主要试剂

    复苏培养基:含有20%灭活FBSRPMI-1640培养基,复苏1管细胞用量30mL。

    注:10%-20%灭活FBS均可,推荐20%灭活FBS

    IMDMDMEMMEM培养基均可,推荐RPMI-1640培养基。

  3. 仪器设备

    恒温水浴锅、生物安全柜(超净工作台)、离心机。

    注:如无恒温水浴锅,用温度37±3℃温水亦可。

  4. 复苏操作流程

    1. 打开恒温水浴锅,水温设置为37℃。

    2. 将复苏培养基孵育至37℃,在生物安全柜内,取9 mL复苏培养基15 mL离心管。

    3. 从液氮罐或超低温冰箱取出冻存管,用钳子夹住冻存管盖子边缘,迅速放入37°C水浴中均匀快速的水平摇晃(勿将管盖浸入水中),直至冻存管中冰晶完全融解,停止水浴(约90s-120s,确定完全融解后再进行转移)。

    4. 75%酒精擦拭冻存管表面以及盖子,在生物安全柜内打开冻存管,并把冻存管内溶液用移液器转移到装有9 mL复苏培养基的15 mL离心管内(转移时吸取和打出液体要轻柔缓慢,15s均匀吸取/打出1mL细胞悬液)。

    5. 吸取1 mL复苏培养基洗涤冻存管,再将洗涤液转移到15 mL离心管内,按以上步骤重复洗涤冻存管一次。轻轻吹打5-7次混匀细胞,离心(20℃,400×g,10 min,accel/brake均为9)。

    6. 离心后,弃上清,加入复苏培养基至10mL,轻轻吹打重悬细胞,离心(20℃,400×g,10 min,accel/brake均为9)。

    7. 离心后,弃上清,吸去残留液体,加入复苏培养基(根据计数需要计算加入复苏培养基的体积,如用血球计数板进行计数,推荐重悬浓度5-10M/mL),轻轻吹打重悬细胞,避免气泡。

    8. 对重悬均匀的细胞悬液进行数量和活率测定。

    5.复苏注意事项

    1. 为避免细胞损失太大,复苏过程尽可能使用15mL离心管。

    2. 如果储存冻存细胞的设备距离水浴较远,应用干冰进行转移,避免冻存细胞在室温中暴露太久。

    3. 融解摇晃过程中,不可将冻存管管盖浸入水中,以免水进入管中,造成污染。

    4. 水浴后不可颠倒或倾斜冻存管,以免造成细胞损失。

    5. 细胞水浴过程操作要稳定快速,转移细胞到离心管以及吹打时操作要轻柔缓慢,切勿快速吹打刚刚复苏的细胞。

    6. 减少弃上清后的液体残留,以保证计数的准确性,但去上清时不可吸到管底细胞。

    7. 复苏后细胞会在一个小时左右恢复到最佳状态,如需对细胞进行损伤性处理,请等待细胞活性达到最佳后进行。

    8. 如需将细胞放置较长时间才能进行实验,则加入复苏培养基至10mL,37℃培养箱内静置或摇床上震荡。

    9. 应按本说明进行复苏操作,且复苏操作过程不能有时间停顿,以保证细胞活性。